蛋白層析柱高效使用與精準(zhǔn)維護(hù)攻略
一、裝柱與平衡階段注意事項
層析柱預(yù)處理
清潔與滅菌：使用前，用去離子水沖洗柱管及配件，去除雜質(zhì)；需滅菌時，采用高壓蒸汽滅菌（121℃，20分鐘）或乙醇浸泡（75%乙醇，≥30分鐘），確保無菌環(huán)境。
墊片與篩板檢查：檢查篩板是否平整、無破損，墊片需緊密貼合柱壁，避免漏液或蛋白泄漏。
填料裝填技巧
填料預(yù)處理：根據(jù)說明書，用緩沖液平衡填料（如Sepharose需懸浮于20%乙醇），去除氣泡并調(diào)整至合適濃度（如10-50%懸浮液）。
裝柱方法：
采用“濕法裝柱”，緩慢倒入填料，避免分層或氣泡。
裝填后用緩沖液輕柔沖洗，流速≤1ml/min（小柱）至≤10ml/min（大柱），直至基線平穩(wěn)（UV280nm吸收值≤0.01AU）。
平衡條件優(yōu)化
緩沖液選擇：與樣品緩沖液成分一致（如pH、離子強(qiáng)度），避免蛋白沉淀或變性。
平衡體積：至少5倍柱體積（CV），復(fù)雜填料（如離子交換）需10-15倍CV，確保填料表面電荷或配基充分平衡。
樣品預(yù)處理
澄清過濾：樣品需經(jīng)0.22μm或0.45μm濾膜過濾，去除顆粒物，防止堵塞篩板。
濃度與體積：上樣量≤填料動態(tài)結(jié)合載量（如DEAE填料蛋白載量10-50mg/ml），體積≤5%柱體積，避免過載導(dǎo)致峰形展寬。
流速與壓力控制
操作壓力：維持柱壓≤0.3MPa（常規(guī)柱），壓力驟升（＞0.5MPa）需立即停泵，檢查是否堵塞。
流速優(yōu)化：
分子篩層析：流速0.5-2ml/min（小柱），保持線性流速≤150cm/h。
離子交換/親和層析：流速1-5ml/min，平衡與洗脫流速需一致。
洗脫策略
梯度洗脫：離子交換層析采用線性鹽梯度（如0-1MNaCl），親和層析用競爭性洗脫液（如咪唑、甘氨酸），需預(yù)實驗確定最佳梯度。
收集管理：按峰收集，每管體積≤1/10柱體積，合并主峰并檢測蛋白濃度（如Bradford法）。
三、清洗與再生注意事項
常規(guī)清洗
緩沖液沖洗：每次運行后，用2-3倍CV起始緩沖液沖洗，去除殘留蛋白。
高鹽清洗：離子交換柱用1-2MNaCl沖洗，去除非特異性結(jié)合蛋白。
深度再生
酸堿處理：
離子交換柱：0.1-0.5MNaOH（堿性填料）或0.1-1MHCl（酸性填料），浸泡30分鐘至2小時。
親和柱：根據(jù)配基特性選擇（如His標(biāo)簽柱用0.1MEDTA解離金屬離子）。
有機(jī)溶劑清洗：疏水層析柱可用20-50%乙醇沖洗，去除脂類或疏水性雜質(zhì)。
消毒與保存
消毒：長期存放前，用0.02%疊氮鈉或20%乙醇沖洗并保存，防止微生物污染。
凍存：特殊填料（如抗體親和柱）可凍存于-20℃（含50%甘油），但需驗證填料穩(wěn)定性。
四、蛋白層析柱常見問題與避坑指南
峰形異常處理
拖尾峰：可能原因包括填料過載、流速過快或柱效下降。解決方法：減少上樣量、降低流速或更換新柱。
肩峰或分裂峰：填料不均一或樣品聚集導(dǎo)致。解決方法：重新裝柱或優(yōu)化樣品緩沖液（如添加助溶劑）。
柱效下降應(yīng)對
柱壓升高：篩板堵塞時，反向沖洗（低流速）或更換篩板；填料壓實則需重新裝柱。
分辨率降低：填料老化需更換，或優(yōu)化緩沖液條件（如pH、離子強(qiáng)度）。
蛋白損失預(yù)防
非特異性吸附：增加平衡體積或添加非離子去污劑（如0.05%Tween-20）。
機(jī)械泄漏：定期檢查柱接頭、墊片，緊固或更換密封件。
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